Séquençage en un éclair

Le 6 février 2007, des dirigeants de 454 Life Sciences ont montré à James Watson, 78 ans, une première ébauche de son propre génome. Il y avait là quelque chose de carrément poétique. Watson, bien sûr, avait remporté un prix Nobel 45 ans plus tôt pour son rôle dans la découverte de la structure en double hélice de l'ADN ; il a également été l'un des principaux moteurs du projet du génome humain, qui, à son achèvement en 2003, avait dépensé près de 3 milliards de dollars sur 13 ans pour extraire le plan que ces hélices codent. Maintenant, 454 avait franchi une étape au-delà de ce mégaprojet, qui regroupait l'ADN de nombreuses personnes pour déterminer la séquence génétique de ce qui équivaut à un humain modèle. L'entreprise et sa soi-disant machine de séquençage de nouvelle génération avaient à elles seules lu le code génétique d'un individu, dont le travail avait tant fait pour rendre la réalisation possible.

Jonathan Rothberg de 454 pense que ses machines rendront le séquençage si bon marché et si rapide qu'il deviendra pratique de lire les génomes des individus.

Mais Jonathan Rothberg, qui a fondé 454 à Branford, CT, avec le rêve de produire une machine de séquençage plus efficace que celles disponibles pour le Human Genome Project, ne mentionne pas la poésie lorsqu'il raconte sa rencontre avec Watson. Il parle plutôt d'argent, de vitesse et d'un avenir dans lequel les gens ordinaires transportent leurs génomes personnels sur des disques – un scénario de plus en plus plausible. Cela nous a coûté 200 000 $ pour faire Jim Watson, souligne Rothberg. Et nous l'avons fait principalement en décembre et janvier.

Cette histoire faisait partie de notre numéro de mai 2007

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Rothberg, qui préside désormais le conseil d'administration de 454, souligne que le projet Jim reste un travail en cours et nécessitera plus de temps et d'argent. En février, la société n'avait séquencé l'ADN de Watson que trois fois (chaque exécution augmentant la précision et comblant les lacunes) ; neuf passes ont été nécessaires pour produire la séquence finale du projet du génome humain. Mais reste.

L'entreprise de Rothberg n'est que l'une d'entre elles, dont Illumina de San Diego et Applied Biosystems de Foster City, en Californie, qui développent des machines capables de décoder l'ADN plus rapidement que jamais. Et tout comme le coût de l'énergie informatique a chuté avec l'augmentation constante de la densité des transistors sur puces, le prix du séquençage de l'ADN a chuté rapidement avec l'avènement de ces machines. Aujourd'hui, le prix à payer sur un génome humain décodé avec des séquenceurs du type utilisé dans le projet du génome humain serait de 25 à 50 millions de dollars. Il tombe à environ 1 million de dollars avec les machines de nouvelle génération disponibles aujourd'hui et pourrait être aussi bas que 100 000 $ d'ici 2008.

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Comme l'histoire des ordinateurs l'a montré, plus de puissance de traitement pour moins d'argent peut conduire à des applications imprévues. Dans le sillage du Human Genome Project, les chercheurs ont été confrontés à des décisions financières difficiles concernant les prochains génomes à séquencer : chimpanzé ou macaque, vache ou dauphin, riz ou manioc. Les nouvelles machines permettent de séquencer presque tout ce qui vous intéresse. Et à mesure que de plus en plus de données de séquences affluent dans les bases de données, de nouveaux domaines de recherche s'ouvrent. Les scientifiques ont désormais une capacité sans précédent de faire des comparaisons entre les espèces, mettant en lumière tout, des questions évolutives aux raisons génétiques des différences individuelles dans la résistance et la susceptibilité aux maladies. Les recherches effectuées avec les machines de 454 et publiées dans les meilleures revues comprennent le séquençage partiel d'un génome de Néandertal et le développement de nouveaux tests pour les mutations génétiques causant le cancer, une technologie qui peut aider les médecins à adapter les traitements à leurs patients.

L'année dernière a été la période la plus passionnante en génomique depuis l'époque du projet du génome humain, déclare Eric Lander, premier auteur de la première version publiée du projet sur le génome humain et maintenant directeur du Broad Institute for genomic Medicine à Cambridge, MA . Le séquençage devient suffisamment bon marché et suffisamment puissant pour pouvoir être appliqué à n'importe quel problème. C'est le terrain sur la tête. Francis Collins, qui a dirigé le projet du génome humain pour les National Institutes of Health, prédit que les nouvelles technologies de séquençage auront des conséquences profondes pour l'avenir de la recherche biomédicale et, en fin de compte, pour la pratique de la médecine.

Une solution unique
Le bureau de Jonathan Rothberg a un thème de dîner, avec un sol en damier rouge et noir, des chaises chromées recouvertes de Naugahyde rouge et un canapé avec des bras qui imitent l'arrière d'une Cadillac 1959, avec des ailerons de queue de monstre et des feux arrière en forme de balle . Au lieu d'un bureau, il a un bar-restaurant avec des tabourets de bar. Des bouteilles de vin d'un vignoble du Connecticut qu'il possède bordent certaines des étagères. Au-delà des fenêtres se trouve le Long Island Sound. L'endroit crie je suis unique . Et c'est ainsi que Rothberg l'est. En 1991, alors qu'il terminait son doctorat en biologie à l'Université de Yale, il a lancé CuraGen, l'une des premières sociétés à développer des médicaments basés sur la génomique. En plus de CuraGen et de 454 Life Sciences, il a fondé un institut pour l'étude des maladies infantiles et une autre société de biotechnologie, RainDance Technologies, qui a développé ce qu'elle appelle des circuits imprimés liquides conçus pour rendre les expériences plus efficaces en manipulant de minuscules quantités. de fluide. Et tout ça à 43 ans.

En effet, c'est l'intérêt pour l'unicité de chaque personne qui l'a finalement conduit à essayer de concevoir un séquenceur qui, espère-t-il, rendra un jour les contrôles du génome aussi routiniers que les tests sanguins le sont aujourd'hui. Rothberg tient les entrailles de la machine 454, une lame de verre avec 1,6 million de puits miniatures, chacun d'environ 50 micromètres de large (environ la moitié de la largeur d'un cheveu humain) et 55 micromètres de profondeur. C'est cette puce qui permet à la machine de séquencer l'ADN si rapidement, car une réaction chimique distincte peut être effectuée dans chaque puits.

Le séquençage des gènes tire parti du fait que les deux brins d'une hélice d'ADN sont complémentaires : des quatre bases chimiques adénine, guanine, thymine et cytosine, qui sont enchaînées dans des ordres différents sur chaque brin, l'adénine ne s'apparie qu'avec la thymine, et guanine uniquement avec la cytosine. Dans la technique de séquençage la plus couramment utilisée, qui s'appuie sur un schéma développé il y a 30 ans par Frederick Sanger de l'Université de Cambridge, des fragments d'ADN sont séparés en brins simples et exposés à des nucléotides libres, qui se lient aux As, Cs, Ts d'origine, et Gs pour générer de nouveaux brins complémentaires. Ces brins varient en longueur car certains des nucléotides libres ont été modifiés pour empêcher la réaction de continuer ; lorsqu'une de ces bases se lie à sa cible, la chaîne cesse de croître. Et chacun de ces quatre types de terminateurs de chaîne a un fluorophore différent attaché qui émet une fluorescence lorsqu'il est frappé par un faisceau laser. Un courant électrique sépare les brins par taille, et le laser lit les couleurs pour déterminer quelle était la dernière base ajoutée à chaque chaîne, en précisant la séquence. La grande majorité des laboratoires qui font du séquençage aujourd'hui utilisent une machine fabriquée par Applied Biosystems qui crache environ deux millions de bases par jour.

Le dernier séquenceur de 454 peut lire 300 millions par jour.

La méthode 454 évite plusieurs des étapes les plus longues du séquençage conventionnel, telles que la séparation des brins par taille. Contrairement au séquençage de Sanger, il ne termine pas les chaînes : il enregistre les bases au fur et à mesure qu'elles sont ajoutées à un brin en croissance. Tout d'abord, une molécule d'ADN est découpée au hasard en différentes longueurs. Ensuite, chaque fragment est dépouillé en brins simples, et chaque brin est attaché à une petite perle séparée. Un processus biochimique copie les brins simples, de sorte que 10 millions de clones sortent de chaque perle. Chaque perle est ensuite emballée dans l'un des 1,6 million de puits. As, Cs, Ts et Gs lavent séquentiellement les puits pour synthétiser de nouveaux brins complémentaires.

Voici la partie vraiment intelligente : en utilisant une méthode décrite pour la première fois par Pål Nyrén et ses collègues du Royal Institute of Technology de Suède, le séquenceur du 454 enregistre instantanément quand une base est ajoutée à chaque brin en exploitant le fait que la réaction de liaison libère un produit chimique appelé pyrophosphate. Dans les puits de la machine 454, le pyrophosphate est capturé par une cascade chimique qui finit par effleurer l'enzyme luciférase (qui se produit naturellement chez les lucioles) – émettant un éclat de lumière. Un dispositif à couplage de charge standard du type utilisé dans les appareils photo numériques et les télescopes détecte chaque flash, en lisant la séquence de As, Cs, Ts et Gs dans chaque fragment. Le processus peut lire environ 200 à 300 bases d'affilée. Comme dans le séquençage conventionnel, les ordinateurs recherchent ensuite les séquences correspondantes à la fin d'un fragment et au début d'un autre, en rassemblant les fragments dans le bon ordre.

Le séquenceur que 454 a mis sur le marché en octobre 2005 avait quelques limitations sérieuses. Il ne pouvait lire que 100 bases d'affilée (plus le tronçon de bases dans chaque fragment séquencé est long, plus il est facile d'assembler un génome complet), et il avait également du mal à cartographier avec précision les tronçons répétitifs - disons, six As dos à dos. Mais Rothberg dit que la philosophie de 454 était de sortir tôt ; le faire accepter. La société a d'abord ciblé les premiers utilisateurs comme Broad's Lander, espérant qu'ils publieraient bientôt des découvertes reposant sur le séquenceur. Il faut d'abord attirer les premiers, mais le reste des gars, les suiveurs, sont là où se trouve le marché, dit Rothberg. Et ils lisent des articles évalués par des pairs.

Néandertaliens
Un article d'un des premiers utilisateurs qui a reçu une large attention de la part des scientifiques et du public était une étude sur l'ADN de Néandertal dirigée par Svante Pääbo de l'Institut Max Planck d'anthropologie évolutive à Leipzig, en Allemagne. Les Néandertaliens, l'espèce la plus proche des humains modernes, ont disparu il y a environ 30 000 ans, et plus de spéculations que de faits entourent leur relation génétique avec nous. Bien que Pääbo ait fait quelques études précédentes avec l'ADN de Néandertal, tout ce qui va au-delà de l'analyse rudimentaire s'est avéré trop difficile et coûteux. Le problème est qu'au cours de milliers d'années, les quelques échantillons connus d'ADN de Néandertal provenant de fossiles ont été dégradés en de courts fragments d'environ 50 à 75 paires de bases. De plus, l'ADN est souvent contaminé par du matériel génétique provenant de micro-organismes et des humains modernes qui ont manipulé les fossiles. Mais Rothberg pensait que la machine 454 pouvait analyser de nombreuses séquences courtes à peu de frais, générant suffisamment d'informations pour permettre aux scientifiques de trier d'anciens trésors de la ferraille. Rothberg a appelé à froid Pääbo, qui a accepté de collaborer.

Après avoir séquencé les gènes de 70 échantillons d'os et de dents de Néandertal, l'équipe de Pääbo et les chercheurs de 454 ont trouvé un échantillon, estimé à 38 000 ans, qui contenait principalement de l'ADN propre. Comme ils l'ont signalé dans un article publié l'automne dernier en La nature , ils ont ensuite séquencé un million de paires de bases à partir de moins de 200 milligrammes de matériel, une réalisation qui a permis de savoir si les humains modernes et les Néandertaliens se sont croisés et quand les deux espèces ont divergé l'une de l'autre. Plus important encore, l'article montre que le séquençage des trois milliards de bases du génome de Néandertal est faisable. Cela pourrait aider à résoudre des mystères tels que celui de savoir si les Néandertaliens avaient la capacité génétique de parler.

Déterminer si les humains et les Néandertaliens se sont croisés ou même avaient la capacité de se parler peut attirer beaucoup l'attention de la presse et du public, mais d'autres applications pour le séquençage ultrarapide de l'ADN pourraient avoir un impact bien plus important sur la médecine et sur nos vies. La méthode de séquençage traditionnelle examine l'ADN de nombreuses cellules différentes. Mais si l'une de ces cellules est, disons, une cellule tumorale, sa séquence peut différer légèrement de celle des cellules saines. Dans de tels cas, les ordinateurs sélectionnent la séquence la plus courante et rejettent les autres. Les séquenceurs de nouvelle génération comme ceux commercialisés par 454 clonent et séquencent à la place des molécules uniques d'ADN, permettant un sondage ultra-profond qui peut déterrer des variantes rares. (Les séquenceurs traditionnels peuvent également analyser des molécules uniques, mais leur coût est prohibitif.) Les implications du séquençage d'une molécule unique sont énormes pour la médecine. Bien qu'il ne soit pas pratique d'utiliser le séquençage conventionnel pour détecter les différences d'ADN entre les cellules saines et malades, les nouvelles machines peuvent facilement effectuer de telles expériences.

Matthew Meyerson, pathologiste clinique au Dana-Farber Cancer Institute de Boston, a publié une étude montrant comment la machine 454 peut aider à découvrir des mutations liées au cancer du poumon. Les médicaments contre le cancer du poumon maintenant disponibles ciblent le gène que Meyerson séquence, et il espère que les médecins finiront par mieux comprendre qui répondra à quels médicaments en apprenant si le patient a une mutation particulière. J'imagine que dans quelques années, tous les patients atteints de cancer verront leurs tumeurs caractérisées par le séquençage d'une molécule unique si la technologie continue de baisser en coût, dit-il.

Dans une variation sur ce thème, Michael Kozal, un clinicien spécialiste du sida à Yale, s'est associé à 454 pour effectuer un séquençage ultraprofond du VIH afin de déterminer la présence de populations mineures de virus résistant aux médicaments. Les premiers tests de la technique chez les patients ont détecté environ deux fois plus de VIH résistant que le séquençage de Sanger. Ces informations pourraient également aider les médecins à individualiser les schémas thérapeutiques, ce qui augmenterait la rentabilité. C'est pratique à faire dans notre système, déclare le scientifique en chef du 454 Michael Egholm, qui collabore avec Kozal. Avant, ce n'était tout simplement pas abordable.

MonGénome
George Church, un pionnier du séquençage à la Harvard Medical School, affirme que le coût est la clé. Au fur et à mesure que leurs prix chuteront dans les prochaines années, dit-il, ces machines deviendront une force de démocratisation qui rendra les séquenceurs traditionnels presque obsolètes, un peu comme les ordinateurs personnels ont remplacé les mainframes. Et cela conduira à des applications que personne ne peut encore imaginer. Si nous travaillions toujours avec des mainframes, beaucoup de choses intéressantes ne se produiraient pas, dit-il.

Church, qui faisait partie de la douzaine de chercheurs à proposer le projet du génome humain au milieu des années 1980, est l'un des rares biologistes dont l'équipement de laboratoire comprend une pince-étau montée sur table et une perceuse à colonne. Il utilise un équipement comme celui-ci pour construire ses propres séquenceurs de nouvelle génération, dont son laboratoire possède actuellement huit (voir TR35 , septembre/octobre 2006 ) . Convaincu que les entreprises surfacturent leurs machines, il met un point d'honneur à partager librement son savoir-faire avec tous ses collègues intéressés. Il compare sa philosophie à la mentalité du wiki et de Linux, en disant : Si un groupe de fourmis se rassemble, elles peuvent déplacer une plante d'hévéa.

La grande vision de Church est de canaliser le flot bon marché d'As, de C, de T et de G dans ce qu'il appelle le Projet du génome personnel. Dans le projet du génome humain, les chercheurs ont obtenu l'ADN de plusieurs personnes, dont chacune, pour des raisons de confidentialité, reste anonyme. Ainsi, la séquence finale représente une personne composite avec un conglomérat de différents antécédents génétiques et antécédents médicaux. Church veut que son projet de génome personnel décode l'ADN d'individus, qui fourniront également volontairement leurs dossiers médicaux. Il publiera toutes les données résultantes sur Internet. En fin de compte, imagine-t-il, des millions de personnes rejoindront le projet, mettant en ligne leurs séquences, leurs dossiers médicaux et, s'ils le souhaitent, même des photographies faciales. Le monde entier aura alors accès à toutes les données dont il a besoin pour tester librement des hypothèses.

Bien que Church ait reçu un financement substantiel des National Institutes of Health pour développer une technologie de séquençage, les questions éthiques, juridiques et sociales soulevées par le projet personnel du génome ont empêché le NIH de le soutenir, malgré un examen positif d'une demande de subvention en août 2005. Dès que j'ai obtenu l'approbation, le NIH est devenu tout excité, et pas nécessairement dans le bon sens, dit-il. Il a tenté de résoudre les problèmes de confidentialité et de confidentialité, notant que l'identité de personne ne doit être rendue publique et que le NIH finance déjà des projets de génétique humaine qui ont moins de garanties en place.

Church reconnaît que la connaissance intime de leur propre ADN pourrait être trop pour de nombreuses personnes. Vous ne laissez pas vos enfants naviguer sur des sites de pornographie sur Internet, dit-il, et dans une certaine mesure, vous ne vous autorisez pas à parcourir les sites les plus effrayants et les plus grossiers. Il s'attend à ce que plutôt que d'accéder à leurs génomes bruts, les gens auront des professionnels pour les aider à interpréter l'information.

Malgré le manque de financement fédéral et les objections éthiques, Church va de l'avant, convaincu que les progrès de la technologie de séquençage feront avancer l'idée d'un projet de génome personnel, tout comme les progrès des technologies de l'information ont conduit des étrangers à partager des données d'une manière dont personne n'aurait rêvé. du moment où l'Apple II à double lecteur de disquette a fait ses débuts il y a 30 ans. À mesure que les séquenceurs deviennent plus efficaces, pense-t-il, et que les coûts continuent de baisser, la génomique personnelle prendra son envol à une échelle que peu de gens ont encore imaginée.

Gagner à la loterie
En octobre dernier, la Fondation X Prize a annoncé un prix de 10 millions de dollars pour la production de séquences très précises de 100 génomes humains en 10 jours ou moins sans dépenser plus de 10 000 $ par génome. L'un des premiers entrants était 454, qui prévoit de développer des billes encore plus petites qui, espère-t-il, permettront à ses machines de lire encore plus d'ADN par passage à peu près au même coût. Nous n'avons besoin d'aucune nouvelle physique ou mathématique pour atteindre le génome de 1 000 $, dit Rothberg.

Laissant de côté la question de savoir quand – ou si – quelqu'un réclamera le X Prize, le séquençage de l'ADN continuera sûrement de chuter en prix et d'augmenter en précision. Jusqu'à l'année dernière, le séquençage avait vraiment du mal à avoir l'impact qu'il devait avoir sur la prochaine ère de la génomique, explique David Bentley, scientifique en chef d'Illumina. Fondamentalement, le prix du séquençage traditionnel ne baissait tout simplement pas assez rapidement. Maintenant, le domaine est beaucoup plus optimiste qu'il ne l'était, dit-il. Le séquençage de nouvelle génération a un rôle énorme à jouer.

Entendre les scientifiques cocher les possibilités, c'est comme écouter les gagnants de la loterie. Et la médecine personnalisée comme le type de test et de traitement du cancer que Meyerson de Dana-Farber espère aider à inaugurer n’est qu’un point de départ. Bentley dit que les nouveaux séquenceurs ouvriront des fenêtres sur les vastes régions non codantes du génome qui activent et désactivent les gènes. Egholm de 454 note que le Human Genome Project n'a pas en fait séquence chaque dernier morceau d'ADN humain ; il peut encore y avoir des gènes non découverts qu'un séquençage supplémentaire peut trouver. Broad’s Lander imagine un torrent de nouvelles informations sur ce qui amène une cellule à se différencier en un type ou un autre (un mystère central en biologie du développement) et ce qui contrôle différents états cellulaires. Je me rends compte que c'est plus difficile à expliquer que de guérir le cancer, dit-il, mais c'est finalement plus important, car cela affectera toutes les maladies.

Au cours de la prochaine année, prédit Lander, les scientifiques seront en mesure de commencer des études qui génèrent des tébases d'informations – un billion d'As, Cs, Ts et Gs. Je n'ai même jamais prononcé le mot térabase avant l'année dernière, dit-il. Et si toutes ces données sont sur le Web et disponibles gratuitement, cela va conduire à un type de biologie complètement différent.

Jon Cohen, écrivain indépendant basé à San Diego et correspondant de La science , travaille sur un livre qui examine les différences génétiques qui séparent les chimpanzés des humains.

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