Séquençage d'une seule molécule d'ADN

Dans le coin des bureaux d'Helicos BioSciences à Cambridge, MA, un écran sur le visage de ce qui ressemble à un réfrigérateur géant affiche un compte à rebours : 10 jours, cinq heures et 51 minutes jusqu'à ce qu'il finisse de lire la séquence de tout l'ADN qui a y a été introduit. La machine à haut débit, une configuration complexe de tubes, de lasers et de produits chimiques, contient deux plaques, chacune avec 25 canaux microfluidiques gravés à l'intérieur. Chaque canal est capable de contenir et de séquencer un échantillon d'ADN distinct. Séquençant les échantillons en parallèle, la machine ne prend qu'une heure pour lire 1,3 milliard de bases chimiques – appelées A, C, T et G – qui constituent un brin d'ADN.

L'HeliScope est la première machine commerciale à séquencer un seul morceau d'ADN plutôt qu'un seul copié plusieurs fois. Chaque Flow Cell (ci-dessus) possède 25 canaux, chacun capable de contenir 16 millions de brins d'ADN pour le séquençage. Un revêtement sur la surface de la cellule permet de la nettoyer entre les réactions.

Appelé HeliScope, il s'agit du premier instrument commercial capable de lire directement la séquence d'un seul de ces brins, une capacité qui lui donne le potentiel d'une vitesse sans précédent. En fait, déclare Stephen Quake, bio-ingénieur à l'Université de Stanford qui a cofondé la société en 2003, Helicos a essentiellement construit le séquenceur d'ADN le plus rapide au monde. Bien qu'il ne soit pas clair si la machine produira une séquence complète plus rapidement que les systèmes concurrents (les données générées par une machine de séquençage doivent encore être analysées et assemblées, une tâche gourmande en calculs), Quake dit qu'elle ouvre de nouveaux domaines de rechercher.

Cette histoire faisait partie de notre numéro de juillet 2008

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L'HeliScope, introduit plus tôt cette année, rejoint une course intense pour des technologies de séquençage plus rapides et moins chères. Le prix du séquençage d'un génome humain a chuté ces dernières années, passant des 300 millions de dollars dépensés par le Human Genome Project pour sa première ébauche à moins de 100 000 $. Les applications du séquençage bon marché sont presque illimitées, du diagnostic des maladies à la recherche qui pourrait produire des microbes conçus pour produire des biocarburants ou des médicaments.

Dans d'autres technologies de séquençage avancées actuellement utilisées, notamment celles d'Illumina, Applied Biosystems et 454 Life Sciences (qui a été acquise par Roche l'année dernière), l'ADN à séquencer doit être amplifié ou copié plusieurs fois ; les copies sont ensuite lues simultanément pour faciliter la détection des signaux fluorescents qui indiquent la position de chaque lettre d'ADN. Le séquençage d'une molécule unique saute l'étape de copie, ce qui signifie que beaucoup plus d'échantillons uniques peuvent être regroupés dans une seule expérience de séquençage.

Multimédia

• Regardez le processus d'Helicos Biosciences pour le séquençage d'une seule molécule d'ADN.

• Stephen Quake, cofondateur de Helicos Biosciences, parle de séquençage.

De plus, le séquençage d'une seule molécule peut être en mesure de générer une image plus complète du génome. En effet, lorsque l'ADN est amplifié, certaines chaînes sont plus susceptibles que d'autres d'être copiées avec succès, elles sont donc plus susceptibles d'être représentées dans la séquence finale. De même, des mutations génétiques rares peuvent ne pas être représentées car elles ne sont pas copiées. Si, en fin de compte, vous pouvez simplement mettre un seul brin d'ADN sur une plate-forme et le séquencer directement, c'est un énorme avantage, déclare Elaine R. Mardis, codirectrice du Genome Center de l'Université de Washington à St. Louis.

Réveillez-vous la nuit
Avec la technologie Helicos, l'ADN à séquencer est d'abord découpé en petits morceaux d'environ 200 bases de long et injecté dans une Flow Cell, une lame de verre spécialisée. La cellule à écoulement est recouverte de minuscules extraits d'ADN conçus pour accrocher les fragments lorsqu'ils flottent, les ancrant en place. Les morceaux d'ADN immobilisés sont marqués par fluorescence afin que leur position sous un microscope à fluorescence puisse être enregistrée par une caméra. Près d'un milliard de morceaux d'ADN peuvent être analysés en une seule expérience de séquençage, contre environ 400 000 à 50 millions pour les autres technologies.

La cellule à écoulement est ensuite nichée dans l'HeliScope, où le microscope est installé dans 400 livres de granit du Vermont. Le poids ajouté empêche les vibrations d'interférer avec les signaux que l'appareil doit détecter. Un système optique complexe et un enchevêtrement de tubes entourent le microscope, le reliant à ce qui ressemble à un réfrigérateur miniature rempli de bouteilles de produits chimiques spécialement conçus.

Lorsqu'un scientifique active la machine, une danse des fluides précisément chorégraphiée commence. Une enzyme appelée ADN polymérase et un seul type de base marquée par fluorescence, disons A, pénètrent dans la cellule. L'enzyme amène ces As à prendre leur place dans les brins d'ADN en croissance qui complètent les brins des échantillons. (Chacune des quatre bases peut s'apparier avec une seule autre base, donc un A ajouté doit s'aligner en face d'un T existant et un C contre un G.) Une fois que la base marquée par fluorescence est incorporée dans le nouveau brin, la caméra de l'HeliScope peut repérer la lumière qu'il émet. L'imageur détecte un panache - un cône de lumière de 200 nanomètres - provenant de l'intégration d'une seule [base] sur un seul brin d'ADN, explique Steve Lombardi, président d'Helicos.

D'autres méthodes de séquençage avancées utilisent une approche similaire, connue sous le nom de séquençage par synthèse. Mais contrairement à ces technologies, l'HeliScope peut distinguer le signal fluorescent non amplifié d'une seule base prenant sa place sur un brin d'ADN en croissance. L'une des clés de cette capacité est un matériau antiadhésif développé par la société, qui recouvre la surface de la cellule à écoulement et permet de la nettoyer entre les réactions : les bases fluorescentes résiduelles rendraient plus difficile la détection précise des réactions de séquençage individuelles. Vous devez vous assurer qu'aucune molécule de base supplémentaire n'adhère à la surface, explique Patrice Milos, directeur scientifique d'Helicos. C'était l'un des premiers défis les plus importants. Après chaque cycle, les marqueurs fluorescents sont coupés des bases nouvellement incorporées et les produits chimiques restants sont lavés. Le processus est répété séquentiellement avec chacune des quatre bases.

L'HeliScope génère une énorme quantité de données brutes chaque seconde. Il faut cinq à dix jours pour lire tout l'ADN qui peut être chargé dans deux Flow Cells ; pour le séquençage, c'est 400 millions de brins d'ADN par cellule, ce qui peut générer 20 milliards de bases de séquence utilisable. Les scientifiques chargent la machine, appuient sur un bouton sur sa face et partent. Mais les obsédés du séquençage peuvent utiliser Internet pour vérifier la progression de la machine en pleine nuit, un phénomène courant chez Helicos.

Une fois que l'HéliScope a réalisé sa série de photographies en fluorescence, un centre informatique d'accompagnement les convertit en chaînes de lettres. Le logiciel colle ces pièces ensemble pour former une séquence plus longue.

Mutations manquantes
Dans un article publié en La science plus tôt cette année, des scientifiques ont rendu compte de leur utilisation de l'HeliScope pour séquencer le génome du virus M13, preuve importante que le séquençage d'une molécule unique pouvait être utilisé pour lire et assembler la séquence d'un génome complet. (D'une longueur d'environ 7 000 paires de bases, le génome du virus M13 est minuscule, soit environ un millionième de la taille d'un humain.) La technologie est si nouvelle qu'on ne sait pas encore à quelles applications elle conviendra le mieux. Mais certains scientifiques pensent que le séquençage d'une molécule unique pourrait être particulièrement important pour comprendre comment les variations génétiques contribuent à la maladie. Après tout, certaines mutations rares liées à la maladie peuvent avoir été manquées dans les études génomiques précédentes parce qu'elles n'ont pas été copiées pendant le processus d'amplification.

Helicos est toujours en train de bricoler la technologie, en développant une chimie qui pourrait augmenter la vitesse des réactions de séquençage et permettre à davantage de morceaux d'ADN d'être ancrés dans une cellule à écoulement. Avec les autres acteurs majeurs du domaine, la société espère livrer une séquence complète du génome pour 1 000 $, une réalisation qui marquerait le début de quelque chose de totalement nouveau en médecine : la capacité des individus à accéder à leurs propres informations génomiques.

Emily Singer est ENFANTS éditeur de biotechnologie et sciences de la vie.

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